В главе представлена информация о коллекции культур микроводорослей ИБМ ДВО РАН. Приводится список видов микроводорослей, поддерживающихся в коллекции в настоящее время, определены основные направления работы с коллекцией.

В России до сих пор нет единой коллекции чистых культур водорослей как фонда хранения генетического материала альгофлоры. В различных научных институтах поддерживаются коллекции культур пресноводных и морских микроводорослей, созданные с разными целями. К таковым относится и коллекция культур морских микроводорослей ИБМ ДВО РАН.

Основной путь пополнения нашей коллекции – выделение в культуру отдельных представителей фитопланктона из прибрежных вод Японского моря, а также из вод других дальневосточных морей России. В настоящее время коллекция включает 31 вид и 39 штаммов морских микроводорослей, относящихся к разным систематическим группам (табл. 7). В настоящей 

работе принято деление водорослей на отделы, предложенное Д.К. Зеровым (1972), с изменениями, которые внесли Вассер с коллегами (1989).

Наиболее широко в коллекции представлены диатомовые водоросли (14 видов) и зеленые водоросли (8 видов).

Культуры водорослей в условиях коллекционного хранения являются альгологически чистыми и поддерживаются в жидких питательных средах различного минерального состава (среды f, f/2 и Гольдберга). Основную часть коллекции содержат в шкафах для хранения культур, оборудованных стеклянными полками и дверцами (рисунок).

Рисунок. Коллекция морских микроводорослей, хранящаяся в специальном шкафу для культивирования.

Водоросли культивируют при периодическом освещении (12 ч свет/12 ч темнота) люминесцентными лампами с интенсивностью 3000–3500 лк при температуре 10–12ºС, 15ºС, 20–22ºС. Регулярно проверяется чистота культур.

Тематика научных исследований, проводимых в институте с использованием коллекционных культур водорослей, разнообразна. Культуры водорослей дают возможность детально изучать биологию, жизненный цикл, особенности морфологии того или иного вида. Систематика и точная идентификация многих видов Bacillariophyta, особенно представителей нано- и пикопланктона, с помощью световой микроскопии затруднены и требуют применения электронной микроскопии. В качестве примера можно привести тот факт, что до последнего времени в литературе существовала путаница в определении видов рода Attheya. Исследования, проведенные на альгологически чистой культуре, позволили обнаружить новый для морей России вид микроводорослей – Attheya longicornis Crawford et Gardner (Орлова и др., 2002). С помощью метода лабораторных культур выделены новые для дальневосточных морей России виды, такие как Chaetoceros socialis f. radians и Thalassiosira proschkinae var. spinulata.

Коллекция культур водорослей имеет эталонную ценность, так как включает аутентичные штаммы, которые выделены из проб, собранных в прибрежных районах зал. Петра Великого (Японское море). Выделение одного из типовых штаммов послужило основой для описания нового вида Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford с типовым штаммом AU-01 (Stonik et al., 2006).

Значительная морфологическая изменчивость клеток водорослей на протяжении жизненного цикла, в особенности представителей рода Chaetoceros (Прошкина-Лавренко, 1955; Орлова, Айздайчер, 2000), может служить причиной для выделения в самостоятельный вид отдельной его стадии. Изучение в культуре мелкоклеточной водоросли C. socialis f. radians позволило получить более полную информацию о морфологических особенностях вида на разных стадиях жизненного цикла, что дало возможность наиболее точно определить его таксономический статус (Шевченко и др., 2008).

Известно, что микроводоросли – основные продуценты органического вещества в морских экосистемах и главный источник пищи для водных животных-фильтраторов. Используя их в пищу, животные получают жизненно важные жирные кислоты, которые не могут синтезировать самостоятельно. Для оценки биологического значения водорослей необходимо знать их жирнокислотный состав. В связи с этим проанализирован состав жирных кислот микроводорослей, представленных в коллекции ИБМ ДВО РАН (Zhukova, Aizdaicher, 1995). Установлено, что качественный и количественный состав жирных кислот можно использовать для оценки физиологического состояния клеток. На примере диатомовых водорослей Pseudo-nitzschia pungens (Grun.) Hasle и Chaetoceros salsugineus Takano показано, что с увеличением возраста культуры в клетках нарушалось образование жирных кислот, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность (Жукова и др., 1998; Zhukova, Aizdaicher, 2001).

Коллекция содержит виды микроводорослей, представляющие интерес для экологических и физиологических исследований. Некоторые виды широко используются в качестве тест-объектов при биотестировании химических веществ и образцов природных и загрязненных вод. Короткий жизненный цикл микроводорослей позволяет проследить действие загрязняющих веществ на нескольких поколениях. Так, изучение роста ряда видов микроводорослей в присутствии детергентов позволило выявить концентрации этих веществ, стимулирующих или ингибирующих развитие водорослей. Кроме того, установлены межвидовые различия в отклике микроводорослей на загрязнения среды детергентами, что позволило расположить виды по уменьшению чувствительности к загрязнению и установить для них пороговые концентрации детергентов (Айздайчер и др., 1999).

В России наиболее распространены биотесты с использованием в качестве тест-объектов зеленых микроводорослей родов Chlorella и Dunaliella. На базе коллекции ИБМ ДВО РАН проводится поиск новых объектов для тестирования морской воды с использованием такого показателя как подвижность клеток микроводорослей (Айздайчер, Маркина, 2006). Реунова с соавторами (2007) описали типы ультраструктурных повреждений в клетке зеленой водоросли Dunaliella salina и определили концентрации селена, приводящие к тотальной клеточной деструкции.

Прибрежные воды, из которых выделены водоросли, представленные в коллекции ИБМ ДВО РАН, испытывают значительное влияние опреснения. Соленость поверхностной воды в летнее время в зал. Петра Великого Японского моря в период тайфунов снижается до 4.25‰ (нормальная соленость составляет 32–34‰) и восстанавливается лишь через трое суток (Гайко, Жабин, 1996). Устойчивость разных видов микроводорослей к опреснению неодинакова. На культурах из коллекции ИБМ ДВО РАН изучено отношение к опреснению нескольких видов водорослей, принадлежащих к разным систематическим отделам. На основании этих 

опытов условно можно выделить три группы видов, по-разному реагирующих на опреснение: 1) виды, переносящие опреснение до 4‰ (Plagioselmis prolonga, Chlorella minutissima, Nannochloris maculata); 2) виды, переносящие опреснение до 16‰ (Pyramimonas cordata, Heterosigma akashiwo, Chaetoceros salsugineus); 3) виды, способные без нарушения роста выдерживать опреснение до 24‰ (Chaetoceros socialis f. radians, Corethron histrix).

В альгологически чистых культурах, как и в прибрежных сообществах, микроводоросли развиваются в тесном контакте с бактериями. В этом случае организмы влияют друг на друга, что приводит либо к стимуляции роста водорослей, либо к его ингибированию. Регуляторная функция экзометаболитов микроводорослей по отношению к бактериям изучена недостаточно. В лабораторных экспериментах культуры водорослей из коллекции ИБМ ДВО РАН используются для изучения взаимоотношений патогенных бактерий и микроводорослей (Терехова и др., 2006).

Микроводоросли из коллекции ИБМ ДВО РАН используются в учебно-педагогическом процессе Дальневосточного государственного университета.

Таким образом, основной принцип работы с коллекцией микроводорослей ИБМ ДВО РАН – это, прежде всего, увеличение таксономического разнообразия коллекции путем пополнения ее видами, являющимися объектами альгологических, биохимических и генетических исследований, перспективных с точки зрения биотехнологии и биотестирования.

новании этих опытов условно можно выделить три группы видов, по-разному реагирующих на опреснение: 1) виды, переносящие опреснение до 4‰ (Plagioselmis prolonga, Chlorella minutissima, Nannochloris maculata); 2) виды, переносящие опреснение до 16‰ (Pyramimonas cordata, Heterosigma akashiwo, Chaetoceros salsugineus); 3) виды, способные без нарушения роста выдерживать опреснение до 24‰ (Chaetoceros socialis f. radians, Corethron histrix).

В альгологически чистых культурах, как и в прибрежных сообществах, микроводоросли развиваются в тесном контакте с бактериями. В этом случае организмы влияют друг на друга, что приводит либо к стимуляции роста водорослей, либо к его ингибированию. Регуляторная функция экзометаболитов микроводорослей по отношению к бактериям изучена недостаточно. В лабораторных экспериментах культуры водорослей из коллекции ИБМ ДВО РАН используются для изучения взаимоотношений патогенных бактерий и микроводорослей (Терехова и др., 2006).

Микроводоросли из коллекции ИБМ ДВО РАН используются в учебно-педагогическом процессе Дальневосточного государственного университета.

Таким образом, основной принцип работы с коллекцией микроводорослей ИБМ ДВО РАН – это, прежде всего, увеличение таксономического разнообразия коллекции путем пополнения ее видами, являющимися объектами альгологических, биохимических и генетических исследований, перспективных с точки зрения биотехнологии и биотестирования.

Таблица 7

Список штаммов микроводорослей коллекции Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН

П р и м е ч а н и е. ИнБЮМ НАНУ − Институт биологии южных морей Национальной академии наук Украины. ССМP − Национальный центр культивирования морского фитопланктона (Center for culture of marine phytoplankton, Bigelow laboratory for ocean sciences, West Boothbay Harbor, Maine 04575 U.S.A.). НЭКМ − Научно-экспериментальный комплекс марикультуры, пос. Большой Утриш, Украина. БиНИИ ЛГУ − Ботанический институт Ленинградского государственного университета, г. Ленинград.

Полученные культуры микроводорослей поддерживают длительное время и, в случае необходимости, наращивают в нужных объемах. Для сохранения альгологически чистой культуры в течение длительного времени маточную культуру, находящуюся на стадии экспоненциального роста, регулярно, не реже одного раза в 5 сут, пересевают в свежеприготовленную 

питательную среду f. Плотность маточной культуры на стадии экспоненциального роста должна составлять не менее 1×10⁴ клеток/мл.

Для проведения работ по пересеву культур микроводорослей предварительно подготавливают рабочее место и посуду в соответствии с рекомендациями, данными в разделе 5. Процедура дезинфекции рук и рабочих поверхностей, которая должна предшествовать пересеву, описана в разделе 8.

Маточную культуру объемом 1 мл стерильными пастеровскими пипетками вносят в колбы Эрленмейера, содержащие 50–70 мл свежеприготовленной среды f.

Плотность культуры клеток после пересева должна составлять не менее 200 клеток/мл.

Колбы Эрленмейера, содержащие культуры микроводорослей, инкубируют в климатостате при тепературе 15–18°С, освещенности 3500 лк и режиме освещения 12 ч свет/12 ч темнота (рисунок).

Рисунок. Климатостат, содержащий колбы и чашки Петри c культурами Pseudo-nitzschia.

Ежедневно проводятся мониторинг культур и их перемешивание: последовательность действий изложена в разделе Поддержание культур.

В процессе работы с накопительными культурами отдельных видов рода Pseudo-nitzschia были отмечены некоторые особенности их роста в условиях перемешивания и без перемешивания.

В накопительной культуре при перемешивании рост численности P. multiseries (клон PM-02) характеризуется S-образной кривой (рисунок).

Рисунок. Рост плотности клеток Pseudo-nitzschia multiseries в культуре в условиях перемешивания.

Плотность исходной культуры должна составлять не менее 1500–2000 клеток/мл. Лаг-фаза короткая, не более 2–3 сут. Суспензия представлена короткими цепочками клеток. Хлоропласты окрашены в зеленовато-коричневый цвет. Через 4 сут происходит переход культуры на 

экспоненциальную фазу роста. В этот период наблюдается максимальная скорость деления (2–2.5 деления в сутки). В суспензии преобладают короткие колонии клеток. Продолжительность экспоненциальной фазы составляет 3–4 сут. Плотность клеток на стадии экспоненциального роста варьирует от 2×10⁴ до 6×10⁴ клеток/мл. Через 7 сут скорость роста замедляется до 0.3–0.5 деления в сутки, и культура переходит в стационарную стадию. Хлоропласты окрашиваются в темно-коричневый цвет. Колонии распадаются на отдельные клетки, которые равномерно оседают на дно колбы. Через 14–16 сут хлоропласты обесцвечиваются, и культура отмирает.

Рост численности P. multiseries (клон PM-02) в накопительной культуре без перемешивания существенно отличается (рисунок).

Рис. 21. Рост плотности клеток Pseudo-nitzschia multiseries в культуре без перемешивания.

Плотность исходной культуры составляет 1500–2000 клеток/мл. Лаг-фаза короткая, не более 2–3 сут. Плотность клеток в этот период уменьшается в два раза по сравнению с плотностью исходной культуры. Через 4 сут численность клеток в накопительной культуре достигает плотности исходной культуры. (1000–2000 клеток/мл).

Суспензия представлена в основном длинными колониями клеток. Хлоропласты окрашены в светло-зеленый цвет. Колонии клеток частично оседали на дно колбы, образуя четко сформированное кольцо, окрашенное в золотистый цвет. В таком состоянии они оставались в течение 45–50 сут, и 

только после этого происходило постепенное обесцвечивание хлоропластов. Колонии клеток были длинными.

Таким образом, перемешивание накопительной культуры Pseudo-nitzschia способствует более интенсивному делению клеток во время экспоненциального роста и быстрому их отмиранию после достижения максимума численности. Перемешивание сказывается и на длине колоний: доля коротких колоний преобладала в течение большей части эксперимента. В том случае, когда суспензию не перемешивали (рис. 21), нарастание численности клеток было не таким интенсивным, развитие культуры сопровождалось несколькими пиками численности клеток. Доля длинных колоний в отсутствие перемешивания преобладала на протяжении всего эксперимента.

В том случае, если в отобранной пробе фитопланктона количество колоний нужного вида незначительно (1 колония на 7–10 полей зрения), прибегают к получению смешанной накопительной культуры микроводорослей. Для этого в 100 мл питательной среды f добавляют 20–30 мл из отобранной пробы фитопланктона, предварительно тщательно перемешав ее, разливают полученную суспензию в 3–4 чашки Петри диаметром 110 мм и экспонируют их на свету при температуре 20ºС в течение 2–3 сут. Затем все чашки просматривают. В случае обнаружения необходимого количества колоний нужного вида (1–2 в поле зрения) приступают к процедуре его выделения в чистую культуру. Порядок и последовательность действий описаны в пункте 10.3. После получения альгологически чистой культуры водоросли переносят из чашек Петри в колбы Эрленмейера для получения накопительной монокультуры.

Небольшую часть накопительной культуры или пробы планктона, содержащей достаточное количество клеток и/или колоний (цепочек) нужного вида, помещают в чашку Петри диаметром 55 или 90 мм или в счетную камеру «Седвик-Рафтер» (Sedgewick Rafter Counting Сells) объемом 1 мл и изолируют одну клетку или одну колонию стерильной капиллярной пипеткой. В течение 10–15 мин изолированную клетку или колонию отмывают от сопутствующего фитопланктона путем трехкратного перенесения в капли стерильной морской воды, нанесенные на стерильное предметное стекло. Затем изолированную и отмытую клетку или колонию стерильной пипеткой переносят в стерильные чашки Петри с питательной средой f. Одна клетка и/или колония помещается в одну чашку Петри. Для успешного получения монокультуры необходимо изолировать не менее 10 клеток и/или колоний.

Чашки Петри с изолированными клетками и/или колониями помещают в климатостат и экспонируют при температуре 18±2°С и освещенности 3500 лк люминесцентными лампами со свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота в течение 3–4 сут (для отдельных видов, например, P. calliantha, чашки с изолированными клетками и/или колониями экспонируют в течение 7–10 сут). Затем содержимое всех чашек просматривают под микроскопом и, в случае увеличения количества клеток и/или колоний, повторяют процесс их изолирования до получения альгологически чистой культуры (монокультуры), которая характеризуется отсутствием в чашках других видов микроводорослей и наличием 2–3 одиночных клеток и/или колоний нужного вида в поле зрения. Затем суспензию клеток из чашки, в которой была монокультура, переносят в коническую колбу Эрленмейера объемом 100 мл, содержащую 50–70 мл питательной среды f; по мере возрастания концентрации клеток в суспензии объем среды постепенно увеличивают. Плотность засева должна составлять не менее 1000 клеток/мл.