Полученные культуры микроводорослей поддерживают длительное время и, в случае необходимости, наращивают в нужных объемах. Для сохранения альгологически чистой культуры в течение длительного времени маточную культуру, находящуюся на стадии экспоненциального роста, регулярно, не реже одного раза в 5 сут, пересевают в свежеприготовленную 

питательную среду f. Плотность маточной культуры на стадии экспоненциального роста должна составлять не менее 1×104 клеток/мл.

Для проведения работ по пересеву культур микроводорослей предварительно подготавливают рабочее место и посуду в соответствии с рекомендациями, данными в разделе 5. Процедура дезинфекции рук и рабочих поверхностей, которая должна предшествовать пересеву, описана в разделе 8.

Маточную культуру объемом 1 мл стерильными пастеровскими пипетками вносят в колбы Эрленмейера, содержащие 50–70 мл свежеприготовленной среды f.

Плотность культуры клеток после пересева должна составлять не менее 200 клеток/мл.

Колбы Эрленмейера, содержащие культуры микроводорослей, инкубируют в климатостате при тепературе 15–18°С, освещенности 3500 лк и режиме освещения 12 ч свет/12 ч темнота (рисунок).

Fig. 20a

 

Рисунок. Климатостат, содержащий колбы и чашки Петри c культурами Pseudo-nitzschia.

 

Ежедневно проводятся мониторинг культур и их перемешивание: последовательность действий изложена в разделе Поддержание культур.

В процессе работы с накопительными культурами отдельных видов рода Pseudo-nitzschia были отмечены некоторые особенности их роста в условиях перемешивания и без перемешивания.

В накопительной культуре при перемешивании рост численности P. multiseries (клон PM-02) характеризуется S-образной кривой (рисунок).

Fig 21a

 

Рисунок. Рост плотности клеток Pseudo-nitzschia multiseries в культуре в условиях перемешивания.

 

Плотность исходной культуры должна составлять не менее 1500–2000 клеток/мл. Лаг-фаза короткая, не более 2–3 сут. Суспензия представлена короткими цепочками клеток. Хлоропласты окрашены в зеленовато-коричневый цвет. Через 4 сут происходит переход культуры на 

экспоненциальную фазу роста. В этот период наблюдается максимальная скорость деления (2–2.5 деления в сутки). В суспензии преобладают короткие колонии клеток. Продолжительность экспоненциальной фазы составляет 3–4 сут. Плотность клеток на стадии экспоненциального роста варьирует от 2×104 до 6×104 клеток/мл. Через 7 сут скорость роста замедляется до 0.3–0.5 деления в сутки, и культура переходит в стационарную стадию. Хлоропласты окрашиваются в темно-коричневый цвет. Колонии распадаются на отдельные клетки, которые равномерно оседают на дно колбы. Через 14–16 сут хлоропласты обесцвечиваются, и культура отмирает.

Рост численности P. multiseries (клон PM-02) в накопительной культуре без перемешивания существенно отличается (рисунок).

Fig.22a

 

Рис. 21. Рост плотности клеток Pseudo-nitzschia multiseries в культуре без перемешивания.

Плотность исходной культуры составляет 1500–2000 клеток/мл. Лаг-фаза короткая, не более 2–3 сут. Плотность клеток в этот период уменьшается в два раза по сравнению с плотностью исходной культуры. Через 4 сут численность клеток в накопительной культуре достигает плотности исходной культуры. (1000–2000 клеток/мл).

Суспензия представлена в основном длинными колониями клеток. Хлоропласты окрашены в светло-зеленый цвет. Колонии клеток частично оседали на дно колбы, образуя четко сформированное кольцо, окрашенное в золотистый цвет. В таком состоянии они оставались в течение 45–50 сут, и 

только после этого происходило постепенное обесцвечивание хлоропластов. Колонии клеток были длинными.

Таким образом, перемешивание накопительной культуры Pseudo-nitzschia способствует более интенсивному делению клеток во время экспоненциального роста и быстрому их отмиранию после достижения максимума численности. Перемешивание сказывается и на длине колоний: доля коротких колоний преобладала в течение большей части эксперимента. В том случае, когда суспензию не перемешивали (рис. 21), нарастание численности клеток было не таким интенсивным, развитие культуры сопровождалось несколькими пиками численности клеток. Доля длинных колоний в отсутствие перемешивания преобладала на протяжении всего эксперимента.

Наверх