Для получения клоновой культуры используют накопительную культуру, полученную при проращивании одной цисты[1].
На стерильное предметное стекло наносят каплю накопительной культуры, содержащей подвижные клетки. На второе стерильное предметное стекло наносят не менее трех капель стерильной среды f/2. Из капли с накопительной культурой микрокапилляром отлавливают одиночную подвижную клетку и переносят ее на предметное стекло в каплю среды. Затем клетку переносят в следующую каплю; этот процесс повторяют не менее трех раз, каждый раз меняя стерильный микрокапилляр. Отмытую изолированную клетку при помощи стерильного микрокапилляра помещают в отдельную пробирку, содержащую 5 мл среды f/2.
Для успешного получения клоновой культуры необходимо изолировать не менее 25 клеток. По окончании этой процедуры пробирки закрывают стерильными колпачками и помещают в климатостат с температурой 15°С, освещенностью 3500 лк и свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота. Через 3 сут и далее ежедневно проводят мониторинг выделенных клеток под микроскопом: просматривают содержимое каждой пробирки и информацию вносят в журнал с указанием даты наблюдения.
После увеличения количества подвижных клеток (до плотности не менее 1000 клеток/мл) 1 мл культуры переносят в колбы Эрленмейера или пластиковые флаконы для культивирования с объемом питательной среды 50 мл (рис. 18).
Рисунок 18. После увеличения количества подвижных клеток динофлагеллят их переносят из пробирок в пластиковые флаконы и/или колбы Эрленмейера.
Пластиковые флаконы и/или колбы Эрленмейера помещают в климатостат (рис. 19) с температурой 15°С, освещенностью 3500 лк и свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота.
Рисунок 19. Климатостат, содержащий клоновые культуры динофлагеллят рода Alexandrium.
Численность культуры на стадии экспоненциального роста должна быть не менее 1×104 клеток/мл. Для поддержания экспоненциального роста клоновых культур динофлагеллят рода Alexandrium пересев на свежеприготовленную среду f/2 осуществляется регулярно один раз в 7 сут.
Порядок действий и последовательность пересевов описаны в разделе "Поддержание культур".
[1]Покоящаяся циста динофлагеллят образуется в результате полового размножения и является диплоидной (то есть несет двойной набор хромосом, 2N). Для получения клоновой культуры (то есть культуры клеток, генетически идентичных исходному материалу) необходимо получить культуру из одной гаплоидной (вегетативной) клетки.