Материалы и методика

Перед началом работ по получению чистых культур микроводорослей температуру пробы воды доводят до 20±2 0C. Вода должна иметь pH 8.0-8.1, содержание кислорода должно быть зимой не менее 4 мг/л, летом - не менее 6 мг/л. Необходимо сразу же после доставки проб в лабораторию провести контрольное наблюдение микрофлоры под микроскопом.

При обнаружении нужного вида в достаточном количестве немедленно приступают к его изоляции. В случае если клетки данного вида присутствуют в пробе, но в недостаточном количестве, пробу оставляют на несколько дней для получения смешанной накопительной культуры. В случае если вид в накопительной смешанной культуре достиг необходимой численности, проводят его изоляцию.

Для проведения работ по изоляции водорослей необходимо отбирать не менее 1 л морской воды. Объем отбираемой воды должен быть в 2-3 раза больше объема, требуемого для работы. Методы отбора, транспортировка, хранение и подготовка к выделению водорослей в культуру должны обеспечить сохранность проб в интервале времени между отбором проб и работой с ними, который не должен превышать 24 ч. Отбор проб из поверхностных и глубоких слоев воды осуществляется в соответствии с ГОСТ 17.1.5.05-85 «Охрана природы. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков». Для отбора проб используют устройства, соответствующие требованиям ГОСТ 17.1.5.04-81 «Охрана природы. Гидросфера. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия».

Мы отбираем пробы вручную, используя батометры системы Молчанова объемом 4 л. Допустимое минимальное количество отбираемых единичных проб для последующего смешения – три.

При отборе проб воды для последующего выделения водорослей в культуру не рекомендуется использовать металлические и полиэтиленовые емкости, а также емкости, бывшие в употреблении.

Процедура измерения температуры воды изложена выше (п. 5.2).

Не допускается консервирование проб, предназначенных для выделения водорослей в культуру. Пробы морской воды необходимо отбирать на значительном расстоянии от берега, где меньше всего сказывается влияние берегового стока. Не рекомендуется отбирать пробы в местах нагона планктона, так как в этом случае присутствует большое количество отмерших водорослей и детрита.

Отобранные пробы наливают, предварительно дважды ополаскивая отбираемой водой, в емкости, заполняют их до краев и плотно закрывают пробкой. Пробы снабжают этикетками с указанием времени и места отбора пробы, упаковывают в коробки. Для лучшей сохранности в жаркую погоду пробы транспортируют в контейнерах-холодильниках при температуре от 4 до 10°С. Не рекомендуется на длительное время оставлять пробы без освещения.

При отборе пробы составляют протокол по утвержденной форме (см. Приложение 2), в котором указывают цель пробоотбора, число, время, место отбора пробы, температуру воды и результаты других измерений, номер пробы.

При отборе проб необходимо соблюдать технику безопасности.

Пробы, поступающие в лабораторию, должны быть зарегистрированы в журнале учета с обязательным указанием номера протокола отбора проб (Приложение 2).

Работу по изолированию водорослей проводят после адаптации температуры пробы к температуре в лаборатории, но не позднее чем через 6 ч после отбора. При невозможности проведения работы в указанный срок пробу хранят при температуре от 4 до 6°С и рассеянном освещении. Хранить пробы можно в течение 24 ч после отбора.

Для приготовления питательных сред с целью культивирования микроводорослей используют природную фильтрованную морскую воду. Природная морская вода представляет комплексный раствор, содержащий более 50 химических элементов и большое разнообразие органических компонентов (Harrison, Berges, 2005). Для приготовления питательной среды необходима морская вода только высшего качества соленостью не менее 30‰. Морскую воду для сред сохраняют в условиях, описанных выше (п. 5.2). Для приготовления сред используют литровые бутыли из тефлона (NALGENE). С целью обеспечения оптимального роста микроводорослей природную морскую воду обогащают основными минеральными солями, микроэлементами и витаминами.

При культивировании зеленых микроводорослей, как правило, применяют среду Гольдберга (Кабанова, 1961). Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, предварительно готовят четыре концентрированных раствора (табл. 1). Растворы готовят на бидистиллированной воде, для приготовления которой нельзя пользоваться аппаратами с ионообменными смолами. Концентрированные растворы солей (кроме солей железа) стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают, после чего их можно использовать для приготовления культуральной среды в течение месяца при условии хранения в темном месте при температуре 4–8°С. Каждый сосуд с питательным раствором должен быть плотно закрыт крышкой и снабжен этикеткой с указанием состава, концентрации и времени приготовления

Таблица 1

Состав исходных растворов для приготовления питательной среды Гольдберга

Компоненты среды

Концентрация, г/100 мл бидистиллированной воды

Раствор № 1

  

KNO3

10.1

Раствор № 2

  

Na2HPO4

1.421

Раствор № 3

  

MnCl2×4H2O

0.02

CoCl2×6H2O

0.024

Раствор № 4

  

FeCl3×6H2O

0.027

Для приготовления питательной среды Гольдберга в 1 л стерилизованной морской воды добавляют: раствор № 1 – 2 мл, раствор № 2 – 0.5 мл, растворы № 3 и 4 – по 1 мл последовательно, перемешивая после внесения каждого раствора.

Для культивирования микроводорослей также широко используют питательную среду f/2, которую готовят на основе фильтрованной и стерилизованной морской воды с добавлением растворов основных минеральных солей, микроэлементов и витаминов (Guillard, 1975). Для приготовления питательной среды f/2 (табл. 2) используют исходные растворы основных минеральных солей (растворы № 1–3), микроэлементов (раствор № 4) и витаминов (раствор № 5) Все указанные растворы готовят на бидистиллированной воде. Каждый сосуд с питательным раствором должен быть плотно закрыт крышкой и снабжен этикеткой с указанием состава, концентрации и времени приготовления.

Таблица 2

Состав питательной среды f/2

Компонент

Концентрация в исходном растворе, г/л бидистиллированной воды

Количество исходного раствора (мл) на 1 л среды

Концентрация в среде f/2, М

Раствор № 1

  

1

  

NaNO3

75

  

8.82×10-4

Раствор № 2

  

1

  

NaH2PO4×H2O

5

  

3.62×10-5

Раствор № 3

  

1

  

Na2SiO3×9H2O

30

  

1.06×10-4

Раствор № 4 (раствор микроэлементов)

См. табл. 3

1

  

Раствор № 5 (раствор витаминов)

См. табл. 4

0.5

  

 

 

Таблица 3

Состав исходного раствора микроэлементов для приготовления питательной среды f/2

 

Компонент

Концентрация в исходном растворе I*, г/л

Количество (г или мл) в 1 л исходного раствора II**

Концентрация в среде f/2, М

CuSO4×5H2O

9.8

1 мл

3.93×10-8

ZnSO4×7H2O

22

1 мл

7.65×10-8

CoCl2×6H2O

10

1 мл

4.2×10-8

MnCl2×4H2O

180

1 мл

9.1×10-7

Na2MoO4×2H2O

6.3

1 мл

2.6×10-8

Трилон

-

4.36 г

1.17×10-5

FeCl3×6H2O

-

3.15 г

1.17×10-5

*Первичный раствор микроэлементов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора микроэлементов.

**Раствор микроэлементов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f/2.

 

Таблица 4

Состав исходного раствора витаминов для приготовления питательной среды f/2

Компонент

Концентрация в исходном растворе I*, г/л

Количество (мг или мл) в 1 л исходного раствора II**

Концентрация в среде f/2, М

Тиамин HCl (витамин В1)

−

200 мг

2.96×10-7

Биотин (витамин В7)

0.1

10 мл

2.05×10-9

Цианкобаламин (витамин В12)

1.0

1 мл

3.69×10-10

*Первичный раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора витаминов.

**Раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f/2.

Чтобы получить исходный раствор микроэлементов для приготовления среды f/2, растворяют 3.15 г FeCl3×6H2O и 4.36 г трилона в 950 мл бидистиллированной воды. Затем к полученному раствору добавляют по 1 мл первичных исходных растворов остальных микроэлементов (табл. 3) и доводят объем исходного раствора микроэлементов до 1 л, добавляя бидистиллированную воду.

Чтобы получить исходный раствор витаминов для приготовления среды f/2, предварительно готовят два раствора – биотина и витамина B12 (табл. 4). Затем в 950 мл бидистиллированной воды растворяют тиамин, добавляют 10 мл исходного раствора биотина и 1 мл исходного раствора витамина B12 и доводят объем раствора витаминов до 1 л, добавляя бидистиллированную воду. Исходный раствор витаминов стерилизуют и хранят в пластиковых емкостях объемом 15 мл в замороженном виде при температуре -20ºС. Для приготовления среды f/2 емкость с витаминами предварительно размораживают. Свежеприготовленный раствор витаминов можно хранить в темном месте при температуре 4ºС не более 60 сут.

Для приготовления питательной среды f/2 в 950 мл стерилизованной морской воды добавляют по 1 мл каждого из исходных растворов основных минеральных солей (растворы № 1-3), 1 мл исходного раствора микроэлементов (раствор № 4) и 0.5 мл исходного раствора витаминов (раствор № 5) последовательно (табл. 2), перемешивая после внесения каждого раствора. Раствор натрия кремнекислого водного (раствор № 3) не используется в среде f/2, предназначенной для культивирования динофитовых водорослей.

Для культивирования диатомовых, зеленых, криптофитовых и некоторых других групп водорослей используют питательную среду f (Guillard, Ryther, 1962), в состав которой входят минеральные соли и микроэлементы (табл. 5), а также витамины (табл. 6).

Таблица 5

Состав питательной среды f

Компонент

Концентрация в исходном растворе, г/л бидистиллированной воды

Количество (мл) в 1 л среды f

Концентрация в среде f, М

Раствор № 1

  

1

  

NaNO3

150

  

17.6×10-4

NaH2PO4×H2O

10

  

7.24×10-5

Раствор № 2

  

1

  

Na2SiO3×9H2O

60

  

2.12×10-4

Раствор № 3

  

1

  

CuSO4×5H2O

0.0196

  

7.86×10-8

ZnSO4×7H2O

0.044

  

15.3×10-8

CoCl2×6H2O

0.02

  

8.4×10-8

MnCl2×4H2O

0.36

  

18.2×10-7

Na2MoO4×2H2O

0.0126

  

5.2×10-8

Раствор № 4

  

1

  

Трилон

8.7

  

2.34×10-5

Раствор № 5

  

1

  

FeCl3×6H2O

6.3

  

2.34×10-5

Раствор № 6

  

1

  

Раствор витаминов

См. табл. 6

    

Таблица 6

Состав исходного раствора витаминов для приготовления питательной среды f

 

Компонент

Концентрация в исходном растворе I*, г/л

Количество (мг или мл) в 1 л исходного раствора II**

Концентрация в среде f, М

Тиамин HCl (витамин В1)

−

400 мг

2.96×10-7

Биотин (витамин В7)

0.1

20 мл

2.05×10-9

Витамин В12

1.0

2 мл

3.69×10-10

*Первичный раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора витаминов.

**Раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f.

Растворы № 1−3 стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин, охлаждают и хранят в холодильнике в течение 30 сут. Для приготовления среды f в 1 л стерилизованной морской воды добавляют по 1 мл каждого из исходных растворов № 1−6 (табл. 5) последовательно, перемешивая после внесения каждого раствора. Исходный раствор витаминов для приготовления среды f готовят как описано выше для среды f/2, учитывая, что концентрация компонентов в среде f в два раза выше, чем в среде f/2 (табл. 6).

На протяжении пяти лет в Центре культивирования морских микроводорослей ИБМ ДВО РАН используют наборы для приготовления питательной среды f/2 (рис. 7), которые производит Национальный центр культивирования морского фитопланктона (CCMP), расположенный в штате Мэн, CША (https://ncma.bigelow.org/). Эти наборы содержат готовые стерильные исходные растворы основных минеральных солей, микроэлементов и витаминов (табл. 2, растворы № 1-5). Один набор рассчитан для приготовления 50 л питательной среды f/2.

Для приготовления питательных сред для культивирования необходимое количество исходного питательного раствора отбирают стерильной пипеткой и вносят в бутыли из тефлона, содержащие стерилизованную и фильтрованную морскую воду (рис.8).

Fig. 8a

Рисунок 8. Приготовление питательной среды на основе готовых растворов , предлагаемых CCMP.

Готовую среду разливают в стерильные емкости, подготовленные для инокуляции, и закрывают стерильными колпачками или крышками, которые предварительно обжигают над пламенем спиртовки. Весь процесс приготовления питательных сред, дозирования, розлива и инокуляции проводится в стерильных условиях (в ламинарном боксе, рабочие поверхности которого предварительно обрабатывают 75% раствором этилового спирта).

 

Для отбора, транспортировки, подготовки и хранения проб морской воды используют пищевые пластиковые бутыли из окрашенного полиэтилентерефталата емкостью 18900 мл (рис. 6).

Fig. 6a

Рисунок 6. Бутыль пластиковая из окрашенного полиэтилентерефталата для отбора, транспортировки и хранения проб морской воды.

Методы отбора, транспортировка, подготовка и хранение должны обеспечить сохранность проб морской воды в интервале времени между отбором проб и работой с ними. Отбор проб в поверхностных слоях воды осуществляется в соответствии с ГОСТ 17.1.5.05-85 «Охрана природы. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков». Пробы отбирают вручную с использованием чистых пластиковых ведер, путем зачерпывания воды в слое 0–0.5 м. При взятии проб измеряют температуру воды. Для этого используют термометры с ценой деления 0.5°С. Для определения температуры на месте взятия пробы 1 л воды наливают в склянку, нижнюю часть термометра погружают в воду и через 5 мин отсчитывают показания, держа его вместе со склянкой на уровне глаз. Точность определения составляет ±0.5°С. pH морской воды измеряют pH-метром. Соленость морской воды определяют в лаборатории с помощью солемера ГМ-65М.

Пробы морской воды необходимо отбирать на значительном расстоянии от берега, где меньше всего сказывается влияние берегового стока. Не рекомендуется отбирать пробы в период «цветения» фитопланктона и в местах нагона планктона, так как в этом случае в воде присутствует большое количество отмерших водорослей и детрита, затрудняющих фильтрацию. Отбор морской воды проводится раз в год в период с 10 по 25 апреля, предшествующий весеннему «цветению» микроводорослей, в определенном районе Амурского залива Японского моря (42°53′ с.ш., 131°40′ в.д.). Эта акватория не подвержена влиянию береговых, бытовых и промышленных стоков.

Подготовленные емкости дважды ополаскивают отбираемой водой, заполняют до краев, плотно закрывают пробкой. Во избежание попадания света в емкости с водой их сразу помещают в плотные черные полиэтиленовые пакеты.

На бутыли наклеивают этикетки с указанием времени и места отбора пробы. Данные о пробе воды вносят в журнал по утвержденной форме, в которой указывают цель пробоотбора, номер емкости, число, время, место отбора, температуру воды. При отборе проб необходимо соблюдать технику безопасности. Пробы, поступающие в лабораторию, должны быть зарегистрированы в журнале учета с обязательным указанием номера протокола отбора проб (Приложение 2).

Не позднее чем через 24 ч после отбора проводят фильтрацию морской воды. Воду фильтруют с помощью пластиковых воронок для обратной фильтрации через лавсановые фильтры с диаметром пор 0.2–1.0 мкм и переливают в бутыли из тефлона (NALGENE) емкостью 18900 мл (рис.7).

Fig. 7a

Рисунок 7. Фильтрация морской воды для приготовления питательных сред для культивирования микроводорослей.

Профильтрованная морская вода хранится в бутылях в специальном помещении, где поддерживается температурный режим 20–22°С. Попадание света в помещение не допускается. Не позднее чем через 24 ч после фильтрации и в последующем каждые 90 сут проводят гидрохимический анализ отобранной пробы морской воды, результаты которого вносят в протокол (Приложение 3).

При соблюдении условий отбора и хранения, описанных в данных рекомендациях, пробы морской воды можно считать «эталонными» для приготовления питательных сред для культивирования микроводорослей и пригодными для использования в течение длительного времени (24 мес и более со дня отбора пробы).

Для проведения работ по выделению микроводорослей в культуру необходимо предварительно подготовить посуду, пробоотборники, место для хранения отобранных проб морской воды и осадков, а также рабочее место. Все эти процедуры должны исключать попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ из окружающей среды в пробы и питательные среды. Важная часть процесса дезинфекции состоит в асептической обработке рук и рабочих поверхностей (лабораторные столы и ламинарные боксы) 70% раствором этанола.

Для отбора проб морской воды используется посуда из пластика и стекла, которая должна быть химически чистой. Стеклянная посуда должна быть изготовлена из боросиликатного стекла. Новые емкости из стекла и пластика предварительно обрабатывают раствором щелочи и затем замачивают на 7 сут в 10% растворе соляной кислоты, после чего несколько раз промывают водопроводной водой и заливают дистиллированной водой до их использования. Лучше всего на всех этапах подготовки посуды в качестве дистиллированной воды использовать апирогенную воду. Нельзя использовать посуду с хромовым покрытием и посуду из алюминия. Использованная посуда пригодна для последующего применения, но должна быть химически чистой. Посуду можно мыть детергентами, предназначенными для обработки лабораторной посуды (нейтральными, не содержащими фосфора). Нельзя использовать для мытья лабораторной посуды бытовые моющие средства, а также хромовую смесь, так как хром токсичен для большинства видов фитопланктона (McLachlan, 1973). Посуду из стекла cтерилизуют в сушильном шкафу при температуре 175°С в течение 2 ч (рис.3).

Fig. 3a

Рисунок 3. Стерилизация посуды для культивирования в сушильном шкафу.

Стерилизация является важным этапом, обеспечивающим создание асептических условий процесса культивирования микроводорослей. Особое значение она имеет при выделении новых культур и получении клонов.

Руки и рабочие поверхности (лабораторные столы и ламинарные боксы) обрабатывают 70% раствором этанола. Посуду для культивирования стерилизуют в автоклаве или микроволновой печи (рис. 4). Режим автоклавирования: давление пара 1.2 атмосферы, температура 121°С, время стерилизации зависит от объемов посуды и составляет 20 или 60 мин. Микроволновая стерилизация является быстрой, эффективной и не токсичной методикой для асептической обработки посуды из стекла и пластика. Желательно использовать инверторные микроволновые печи (рис. 4). Режим микроволновой стерилизации для тефлоновой посуды объемом 1 л, содержащей культуральную среду: 2 мин−1мин−2 мин с интервалом 30 с при мощности 700W (кипение жидкости не допускается).

Fig 4a

 Рисунок 4.Стерилизация посуды для культивирования в инвенторной микроволновой печи.

Стерильная посуда закрывается герметизирующей пленкой «Parafilm» и хранится отдельно от остальной лабораторной посуды в закрытых шкафах, предназначенных только для хранения посуды для культивирования микроводорослей (рис.5).

Fig. 5a

Рисунок 5. Шкаф для хранения посуды, используемой для культивирования микроводорослей.

Тефлоновая посуда применяется только для хранения базовых растворов для приготовления питательных сред и не пригодна для культивирования из-за низкой светопроницаемости.

Работы по культивированию проводят в лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150-69 (рисунок). Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Температура воздуха в лаборатории 22–25оС, в люминостате для пересева культур – 15°С для культур динофитовых водорослей рода Alexandrium и 20–22°С для культур диатомовых водорослей рода Pseudo-nitzschia.

Относительная влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С.

Атмосферное давление 84.0–106.7 кПа (630–800 мм. рт. ст).

Напряжение в сети 220±10 В.

Частота переменного тока 50±1 Гц.

Освещение помещения не ограничено особыми требованиями. Освещение в боксе ламинарном и климатостате обеспечивается лампами дневного света. Интенсивность освещения 3000–4000 лк.

Fig. 2a

Рисунок 2. Лаборатория Центра культивирования морских микровоорослей ННЦМБ ДВО РАН.

Коллекции

Наверх