В данной главе даны методические рекомендации для лабораторного культивирования динофитовых водорослей рода Alexandrium, продуцирующих сакситоксин и его аналоги. Для культвирования микроводорослей Alexandrium spp. используют питательную среду f/2. Методика ее приготовления изложена в разделе 6.

Метод культивирования динофлагеллят рода Alexandrium основан на изолировании цист микроводорослей из проб поверхностных осадков и их выращивании в условиях лабораторной культуры. Критерием успешного применения методических рекомендаций является получение клоновой культуры вида, рост которой описывается S-образной кривой. Для динофлагеллят рекомендовано получение клоновой культуры, которую получают из одной клетки и которая характеризуется тем, что все клетки в такой культуре генетически идентичны исходному материалу. Численность культуры видов рода Alexandrium на стадии экспоненциального роста должна быть не менее 1×10⁴ клеток/мл. Для поддержания экспоненциального роста микроводорослей пересев на свежеприготовленную среду f/2 осуществляется регулярно один раз в 7 сут.

Виды рода Alexandrium широко известны как продуценты паралитического токсина (в частности сакситоксина и его аналогов), который передается по пищевым цепям, вызывая отравления людей, а также массовую гибель теплокровных животных. Около десяти представителей этого рода способны продуцировать токсины, которые воздействуют на нервно-мышечную, сенсорную, пищеварительную и сердечно-сосудистую системы человека. Такое отравление получило название «паралитическое отравление моллюсками» или, в англоязычной литературе – Paralytic Shellfish Poisoning (PSP). Ежегодно в мире регистрируются десятки тысяч случаев отравления людей паралитическим токсином вследствие употребления в пищу рыбы, моллюсков и других морепродуктов (Shumway, 1990; Hallegraeff, 1995). Случаи «цветения» токсичных видов рода Alexandrium, сопровождавшиеся отравлениями и гибелью людей и морских животных, зарегистрированы и на 

Дальнем Востоке РФ. Наиболее часто токсичные «цветения» вызывает вид Alexandrium tamarense.

В настоящее время род Alexandrium включает 29 валидных видов и несколько видов сомнительных или имеющих предварительное описание (Balech, 1995; Yoshida, Fukuyo, 2000). Из них 10 видов способны продуцировать токсины (Balech, 1995). В морях и сопредельных водах России отмечено восемь видов рода Alexandrium: A. acantenella, A. catenella, A. insuetum, A. margalefii, A. ostenfeldii, A. pseudogonyaulax, A. tamarense и A. tamutum (Селина и др. 2006), среди которых A. tamarense – наиболее распространенный и многочисленный вид. Вид продуцирует сакситоксин и его аналоги (гониотоксины, неосакситоксин и др.) (Oshima et al., 1989). Цисты этого вида могут быть токсичными, иногда их токсичность на порядок превышает токсичность вегетативных клеток (Dale et al., 1978). Установлена токсичность всех клонов этого вида, полученных при проращивании цист, собранных вдоль тихоокеанского побережья России (Orlova et al., 2007). Случаи отравления людей при употреблении в пищу моллюсков во время красных приливов, обусловленных «цветением» A. tamarense, были зарегистрированы у берегов Камчатки и в Беринговом море (Коновалова, 1992).

Для большинства видов рода Alexandrium показано существование как токсичных, так и нетоксичных клонов (клеточных линий). Уровень продукции и состав токсинов часто существенно различается у разных клонов (Orlova et al., 2007). Современные исследования показывают, что способность клонов продуцировать токсин связана с их филогенетическим положением и влиянием природных факторов (Scholin, Anderson, 1994). Согласно литературным данным, сакситоксин и его аналоги синтезируются не только динофлагеллятами, но и цианобактериями и другими бактериями (Кodama et al., 1990).

Помимо PSP токсинов, некоторые виды рода Alexandrium способны продуцировать гемолитический и ихтиотоксины (Ogata, Kodama, 1986; Simonsen et al., 1995).

Методика культивирования видов рода Alexandrium была успешно применена сотрудниками ИБМ ДВО РАН для получения токсичных клоновых культур вида A. tamarense (Приложения 4 и 5). Динофитовые водоросли рода Alexandrium в настоящей работе классифицируются в соответствии с системой морских динофлагеллят А. Сурниа (Sournia, 1986), модернизированной М. Хретиннот-Динет с коллегами (Chretiennot-Dinet et al., 1993).

Небольшую часть собранной пробы помещают в чашку Петри диаметром 55 мм или 90 мм или в счетную камеру «Седвик-Рафтер» (Sedgewick Rafter Counting cells) объемом 1 мл и под микроскопом стерильной капиллярной пипеткой изолируют одну клетку или одну колонию, состоящую из нескольких клеток (рисунок).

Изоляция колонии стерильной капилярной пипеткой под инвертированным микроскопом 

На стерильное предметное стекло наносят каплю стерильной морской воды и в нее переносят изолированную клетку или колонию клеток (рис. 9). Процесс повторяют не менее трех раз, каждый раз заменяя стерильную пипетку. Таким образом отмывают клетку от сопутствующих водорослей и бактерий.

Рисунок. Изолированную колонию отмывают путем ее трехкратного перенесения в капли стерильной морской воды на стерильном предметном стекле.

После отмывания клетку или колонию переносят в стерильную чашку Петри с питательной средой. Одна клетка или колония помещается в одну чашку Петри. Для успешного получения монокультуры необходимо параллельно изолировать не менее 10 клеток или колоний. Чашки с изолированными клетками или колониями помещают в климатостат с температурой 20°С, освещенностью 3500 лк и свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота.

Ежедневно проводят мониторинг изолированных клеток под микроскопом: просматривают содержимое каждой чашки и при обнаружении увеличения количества цепочек повторяют процесс изолирования колонии. При условии отсутствия в чашках других видов микроводорослей и увеличения количества колоний необходимого вида культуру переносят в культуральные пробирки с объемом питательной среды 20 мл или колбы Эрленмейера с объемом питательной среды 100 мл. Плотность засева должна составлять не менее 1000 клеток/мл.

Полученные культуры поддерживают длительное время и в случае необходимости наращивают в нужных объемах. Для поддержания культур регулярно, не реже одного раза в 7 сут, маточную культуру, находящуюся на стадии экспоненциального роста, пересевают на свежеприготовленную питательную среду. Процедура приготовления и состав сред изложены в разделе 6. Плотность маточной культуры на стадии экспоненциального роста должна составлять не менее 1×10⁴ клеток/мл.

Для проведения работ по пересеву культур предварительно подготавливают рабочее место и посуду в соответствии с рекомендациями, данными в разделе 5. Все процедуры должны исключать попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ из окружающей среды в культуральный материал и питательные среды. Важная часть процесса дезинфекции состоит в асептической обработке рук и рабочих поверхностей (лабораторные столы и ламинарные боксы) 70% раствором этанола. Пересев проводится над пламенем спиртовки, в ламинарном боксе, в котором до начала работ по пересеву включают бактерицидную лампу на 30 мин.

Маточную культуру объемом 1 мл стерильными пипетками вносят в емкости для культивирования. Это могут быть пластиковые емкости или стеклянные пробирки объемом 50 мл или колбы Эрленмейера объемом 100 мл, содержащие 50 мл свежеприготовленной питательной среды.

Плотность культуры клеток после пересева должна составлять не менее 200 клеток/мл.

Емкости, содержащие культуры клеток, инкубируют в климатостатах (рисунок), которые поддерживают заданную температуру (10°С, 15°С или 22°С) при освещенности 3500 лк и свето-темновом периоде 12 ч свет/12 ч темнота.

Рисунок. Климатостат c культурами микроводорослей.

Некоторые культуры, поддержание которых не требует специального температурного режима, содержат в шкафах для хранения культур, оборудованных стеклянными дверцами и полками. В помещении, где хранится коллекция таких культур, поддерживается температура 20–22°С, освещенность 3500 лк и режим освещения 12 ч свет/12 ч темнота.

Ежедневно проводится мониторинг культур: их состояние оценивается визуально и/или с помощью стереоскопического микроскопа. Результаты наблюдений регистрируются в рабочем журнале и в паспорте клона (Приложение 3).

Ежедневно в одно и то же время, после окончания темнового периода, суспензию водорослей вручную медленно перемешивают. Эта процедура выполняется для того, чтобы улучшить газообмен и выровнять значения рН за счет выделяющегося углекислого газа в колбах с культурами.

Для получения накопительной культуры в колбу Эрленмейера, содержащую 150 мл питательной среды, добавляют 50 мл тщательно перемешанной собранной пробы, содержащей клетки нужного вида. Содержимое колбы (200 мл) разливают по чашкам Петри диаметром 55 или 90 мм и на 3 сут оставляют при освещении 3500 лк. Затем чашки просматривают под бинокулярным микроскопом. При обнаружении достаточного количества клеток или колоний нужного вида (2–3 одиночных клетки или колонии в одном поле зрения) приступают к выделению вида в монокультуру.