• Методика подготовки проб диатомовых водорослей к изучению морфологии с помощью трансмиссионной электронной микроскопии

на основе традиционных методов очистки панцирей, включающих обработку серной кислотой и насыщенными водными растворами перманганата калия и щавелевой кислоты, а также центрифугирование с дистиллированной водой (Lundholm et al., 2002). Для изучения материала с помощью ТЭМ каплю отмытой пробы наносили на бленды с формваром и сушили на воздухе.

Lundholm N., Daugbjerg N., Moestrup Ø. Phylogeny of the Bacillariaceae with emphasis on the genus Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) based on partial LSU rDNA // Eur. J. Phycol. 2002. Vol. 37. P. 115-134.

  • Методика определения содержания домоевой кислоты в лабораторных культурах диатомовых водорослей с помощью конкурентного иммуноферментного анализа

При данной методике используется набор реагентов ASP direct cELISA kit (Biosence laboratories AS, Norway). Тест-система ASP direct cELISA прошла полную межлабораторную проверку в международном масштабе, по результатам которой утвержден официальный метод АОАС 2006.02 (Official method …, 2006), рекомендованный регулирующим документом Еврокомиссии COMISSION REGULATION (EC) No 1244/2007 от 24.10.07 для целей скрининга моллюсков на содержание домоевой кислоты.

Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL (2006) 19th Ed., AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD USA, Official Method 2006.02

  •  Методика определения интенсивности флуоресценции на заданной длине волны испускания с использованием луночных планшетов или модуля кюветы на планшетном ридере Spark 10М Tecan
  • Методика сканирования оптической плотности раствора (абсорбции) в заданном диапазоне длин волн с использованием луночных планшетов на планшетном ридере Spark 10М Tecan
  • Методика подсчета численности клеток на планшетном ридере Spark 10М Tecan
  • Методика измерения оптической плотности раствора (абсорбции) на заданной длине волны с использованием луночных планшетов или модуля кюветы на планшетном ридере Spark 10М Tecan
  • Методика световой микроскопии при исследовании строения грибных структур с использованием просвечивающей световой микроскопии

Для идентификации мицелиальных грибов изучаются следующие таксономичекие признаки: строение конидиального аппарата (конидиеносцев, конидий) у анаморфных стадий сумчатых грибов, строение аскокарпов, сумок, аскоспор у аскомицетов, строение спорангиального аппарата (спороносцев, спор) у зигомицетов, а также морфолого-культуральные характеристики колоний грибных изолятов.

Iqbal Ahmad and Mohd Sajjad Ahmad Khan. 2012. Microscopy in mycological research with especial reference to ultrastructures and biofilm studies. In: Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology (A. Méndez-Vilas, Ed.). FORMATEX. P. 646-659.

  •  Методика выделения бактерий из различных природных объектов

Образцы воды, грунта, биопленок обрастания, тканей гидробионтов и пр. отбираются асептически в стерильные флаконы и в кратчайшее время (не более 2-х часов с момента отбора) доставляются в лабораторию для анализа. Там образцы гомогенизируют и высевают в серийных разведениях на соответствующие бактериальные среды. Для получения чистой культуры штаммов бактерий пересевы из одной колонии производят трехкратно. Чистота культуры проверяется в окрашенных по Граму мазках под световым микроскопом Zeiss Primo Star с использованием масляной иммерсии, объектив х100.

  • Методика культивирования бактерий

Для культивирования бактерий используются жидкие и плотные среды. Засев производится суточной культурой бактерий. Перед засевом проверяется чистота культуры. Для жидких сред используются стеклянные пробирки объемом 16 мл, для плотных – чашки Петри 9 см диаметром. Наиболее часто применяются жидкий и плотный морской бульон Marine Broth и морской агар Marine agar 2216 (Difco), а также жидкая и плотная среда Йошимицу-Кимура (Youschimizu and Kimura, 1976). 

Youchimizu, M., Kimura, T., 1976. Study of intestinal microflora of Salmonids. Fish. Pathol. 10 (2), 243-245.

  •  Методика идентификации бактерий

Аанализ фенотипических свойств бактерий. Окрашивание по Граму проводится согласно Smibert and Krieg (1994). Морфология клеток наблюдается в мазках по Граму, наличие жгутиков - на трансмиссионном микроскопе (JEOL JEM-2100, Japan). Тесты на способность утилизировать различные субстраты, наличие каталазы, нитратредуктазы, цитохромоксидазы, продукции индола проводятся согласно Smibert and Krieg (1994). Гидролиз желатины, крахмала, уреазы, окисление и ферментация глюкозы проводятся согласно (Hugh and Leifson, 1953). Определение кислотообразования, утилизации источников углерода и азота, активности ряда ферментов и другие дополнительные биохимические характеристики проводятся с использованием тест-систем API 50CH/B, API 20E и API ZYM (bio-Mèrieux, France) согласно рекомендациям производителя. В качестве дополнительного критерия характеристики бактериальных культур исследуется жирнокислотный профиль липидов клеточных стенок бактерий согласно (Svetashev et al., 1995). Состав Г/Ц оснований хромосомной ДНК проводится согласно методике Мармура (Marmur, 1961). Окончательная идентификация проводится с использованием молекулярно-генетических методов, в частности, секвенирования гена 16S рRNA.

Smibert RM, Krieg NR. Phenotypic characterization. In: Gerhardt P (editor). Methods for General and Molecular Bacteriology. Washington, DC: American Society for Microbiology; 1994. pp. 607–654.

Hugh R., Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 1953, 66, 24–26.

Svetashev V.I., Vysotskii M.V., Ivanova E.P., Mikhailov V.V. Cellular fatty acids of Alteromonas species. Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 37–43.

Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 208–218.

  • Методика анализа антимикробных свойств бактерий

Анализ антимикробной ктивности гетеротрофных бактерий проводится согласно метода Penesyan et al. (2009). Суточные бактериальные культуры засеваются на поверхность чашки петри с морским агаром и культивируются 96 ч. Затем поверхность агара покрывается 25 мл теплого 0.7 % агара, содержащего 0.5 мл суспензии тест – культуры. Верхний слой агара содержит следующие среды: для S. aureus, Luria–Bertani (LB), г/л: NaCl, 10; триптон, 10; дрожжевой экстракт, 5; для Candida albicans, пептонно-дрожжевой агар (г/л): пептон, 20; дрожжевой экстракт, 10; глюкоза, 20, для E. coli, Bacillus subtilis, и Pseudomonas aeruginosa, триптозный соевый бульон (TSB) (Difco, United States). Для приготовления клеточной суспензии ночные культуры бактерий, выросшие на соответствующей среде, разводились физиологическим раствором до концентрации 109 кл/мл с использованием стандарта мутности Мак-Фарланда. Чашки Петри с двойным агаром инкубировали при 25°С 48 ч, затем измеряли зоны отсутствия роста вокруг колоний морких изолятов. Зоны 4 и более мм в диаметре считаются позитивным результатом согласно (Long and Azam, 2001).

Penesyan A, Marshall-Jones Z, Holmstrom C, Kjelleberg S, Egan S. Antimicrobial activity observed among cultured marine epiphytic bacteria reflects their potential as a source of new drugs. FEMS Microbiol Ecol. 2009 V. 69 (1). P. 113-24.

Long, R.A. and Azam, F. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria, Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4975–4983.

  • Методика анализа устойчивости бактерий к антибиотикам

Анализ устойчивости к антибиотикам проводится с использованием бумажных дисков, импрегнированных соответствующими антибиотиками (Oxoid) методом диффузии в Mueller–Hinton агар, обогащенный 2 % NaCl. Результаты интерпретируются согласно CLSI (2006).

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006. Methods for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animals; Approved Guideline. CLSI, Document M42-A. Wayne, Pennsylvania; ISBN 1-56238-611-5

  • Методика хранения бактериальных штаммов

Часть штаммов Коллекции гетеротрофных бактерий хранится в автоматизированной системе биобанктрования LiCONiC STC Compact ULT при -80°C в Морском биобанке ННЦМБ ДВО РАН. Кроме того, бактериальные штаммы сохраняются при –85°C в криопробирках 2 мл на морской воде, содержащей 1% пептона, 30% глицерина в качестве криопротектора, и MgSO4 в концентрации 35 г/л, в низкотемпературном морозильнике MDF-U3086S (Sanyo) в Музее ННЦМБ ДВО РАН.

Наверх