К проведению работ по культивированию допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж и освоившие в процессе стажировки методические приемы выделения и поддержания культур микроводорослей.

Сотрудники Центра культивирования морских микроводорослей ННЦМБ ДВО РАН.

При выполнении работ с культурами микроводорослей и химическими реактивами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.1.007.

Помещение, в котором проводятся работы по культивированию, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.1.005.

Внимание! Культуры микроводорослей могут содержать токсины – сакситоксин и его аналоги, домоевую кислоту и др. При работе с культурами следует использовать спецодежду и резиновые перчатки по ГОСТ 12.4.013 и избегать контакта суспензий культур с кожей.

Электробезопасность обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и по требованиям, указанным в технической документации на вспомогательные устройства.

Помещения лаборатории должны соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.003.

Помещения лабораторий, рабочие места должны содержаться в чистоте. Обязательно проводится ежедневная влажная уборка рабочих поверхностей.

Тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 мин в 5% растворе гипохлорида натрия с последующим добавлением в раствор ацетона (5% по объему) и выдерживанием в течение 30 мин. Затем лабораторную посуду мыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

В настоящем пособии мы приводим методику получения и длительного лабораторного культивирования одноклеточных водорослей, которая успешно применяется в Центре культивирования морских микроводорослей ИБМ ДВО РАН. В настоящее время мы поддерживаем коллекцию культур морских микроводорослей, включающую 31 вид и 39 штаммов, среди которых есть клоны и штаммы видов, продуцирующих фикотоксины. В качестве примера культивирования токсичных видов микроводорослей дано описание методик получения клоновых культур видов рода Alexandrium, продуцирующих сакситоксин, и штаммов видов рода Pseudo-nitzschia, продуцирующих домоевую кислоту.

Метод получения культур одноклеточных водорослей основан на их изолировании из проб морской воды или поверхностных осадков и выращивании в условиях лабораторной культуры. Критерием успешного применения методических рекомендаций является получение альгологически чистой культуры вида, рост которой описывается S-образной кривой. Для динофлагеллят рекомендовано получение клоновой культуры, которую выделяют из одной цисты и которая характеризуется тем, что все клетки в такой культуре генетически идентичны исходному материалу. Для диатомовых водорослей предлагается методика получения штаммов микроводорослей, выделенных из одной клетки или цепочки, взятых из природной среды. Численность культуры на стадии экспоненциального роста должна быть не менее 1×10⁴ клеток/мл. Для поддержания экспоненциального роста микроводорослей пересев на свежеприготовленную среду осуществляется регулярно, не реже одного раза в 7 сут. Полный перечень средств измерений, реактивов, вспомогательных устройств и материалов, необходимых для культивирования микроводорослей, приведен в Приложении 1.

Термин «культивирование» в практику альгологических исследований ввел Ф. Кон (1850; цит по: Algal Culturing Techniques, 2005), которому впервые в лабораторных условиях удалось содержать одноклеточную жгутиковую водоросль Haematococcus pluvialis. Раствор неорганических солей в качестве питательной среды впервые был успешно использован российским физиологом А.С. Фаминцыным для культивирования двух видов зеленых микроводорослей (Kuznetzov, Stroganov, 1995). Первые аксеничные культуры морских планктонных водорослей, в частности диатомовых, были получены в 1890 г. П. Мигелем. Он же впервые использовал микропипетку для изолирования клеток и получения клоновых культур (Algal Culturing Techniques, 2005). Значительный вклад в разработку методов лабораторного культивирования морских микроводорослей внесли Е. Аллен и Е. Нельсон (Allen, Nelson, 1910). Применение искусственной морской воды предложенного ими состава позволило получить культуры диатомовых водорослей родов Chaetoceros, Skeletonema и Thalassiosira, которые использовались для кормления личинок морских беспозвоночных. Эти микроводоросли являются важнейшим источником пищи для искусственно разводимых морских животных и в настоящее время. В 1912 г. E. Прингсгейм публикует первую из серии работ по методам культивирования водорослей (Pringsheim, 1912). Работы этого автора (Pringsheim, 1924, 1946) длительное время были одним из основных руководств по культивированию водорослей.

Большинство методов культивирования одноклеточных водорослей, применяемых в настоящее время, были разработаны в конце XIX - начале XX веков. Техника культивирования микроводорослей, в том числе и морских видов, подробно изложена во многих монографиях и статьях, посвященных этому вопросу (Moore, 1903; Richter, 1903; Küster, 1908; Pringsheim, 1924; Uspenski, Uspenskaja, 1925; Bold, 1942; Fogg, 1965; Handbook of physiological methods…, 1973; Guillard, 1975; CRC Handbook of microalgae mass cultures, 1986; Algal culturing techniques, 2005).

В настоящее время коллекции морских микроводорослей, насчитывающие тысячи клонов, поддерживаются в многочисленных центрах, институтах и лабораториях CША, Великобритании, Германии, Франции, Дании, Австралии, Японии и других стран. Их деятельность координируется Всемирной федерацией по коллекциям культур (WFCC), созданной в 1963 г. под эгидой Международного союза микробиологических обществ (IUMS) и Комиссии Международного союза биологических наук (IUBS). Крупнейшая мировая коллекция морских микроводорослей, насчитывающая 2700 штаммов, поддерживается Национальным центром культивирования морского фитопланктона (ССMP), расположенным в штате Мэн, CША.

В Институте морских биологических исследований им. А.О. Ковалевского РАН (ИМБИ РАН) хранится самая многочисленная (более 40 видов) коллекция культур микроводорослей среди коллекций, собранных в учреждениях стран бывшего Советского Союза. В течение пяти десятилетий здесь разрабатывали и совершенствовали методики получения монокультур одноклеточных водорослей и их длительного хранения. Этот уникальный опыт и культуры из коллекции одноклеточных водорослей Л.А. Ланской (1971) до сих пор широко используют ученые биологических и химических учреждений стран бывшего Советского Союза.

В Национальном научном центре морской биологии ДВО РАН (ННЦМБ ДВО РАН) первые успешные попытки введения в культуру некоторых массовых видов микроводорослей из Амурского залива Японского моря были предприняты в 1970-х гг. Г.В. Коноваловой. Результаты этих опытов были включены в монографию «Атлас фитопланктона Японского моря» (Коновалова и др., 1989). Работы по культивированию микроводорослей на постоянной основе были начаты в ИБМ ДВО РАН в 1985 г. по инициативе академика А.В. Жирмунского. Необходимость создания коллекции живых культур морских микроводорослей в ИБМ ДВО РАН была вызвана работами, связанными с изучением эмбрионального развития и экологии личинок беспозвоночных животных. С тех пор более двадцати лет в разных лабораториях института успешно проводят исследования с использованием одноклеточных водорослей. Основу коллекции составили культуры семи видов, полученных из ИнБЮМ НАНУ. Пополнение коллекции микроводорослей происходит несколькими путями: получением образцов культур из других учреждений, обменом культурами и выделением в культуру отдельных представителей фитопланктона из прибрежных вод зал. Петра Великого Японского моря. В настоящее время наша коллекция включает 31 вид и 39 штаммов морских микроводорослей, относящихся к разным систематическим отделам.

В течение 25 лет в ИБМ ДВО РАН разрабатывали и совершенствовали методики выделения микроводорослей в альгологически чистые культуры. В последние годы тематика научных исследований с использованием культур микроводорослей значительно расширилась. Они применяются не только для проведения фундаментальных исследований, но и широко используются для решения прикладных задач биотехнологии. Особое внимание исследователей морские микроводоросли привлекают как продуценты фикотоксинов. Сотрудники ИБМ ДВО РАН на протяжении последних 10 лет активно разрабатывают и совершенствуют методы лабораторного культивирования морских микроводорослей, продуцирующих токсины.

Представленные в настоящем пособии методики культивирования успешно применяются для выделения и содержания в условиях лабораторной культуры токсичных штаммов микроводорослей, продуцирующих домоевую кислоту, сакситоксин и его аналоги. Эти методики являются малозатратными и удобными в применении и позволяют быстро и эффективно выделять новые культуры, наращивать биомассу микроводорослей до необходимых концентраций и поддерживать культуры в течение длительного времени.

Материалы сайта опубликованы в книге  Орлова Т.Ю., Айздайчер Н.А., Стоник И.В. Лабораторное культивирование морских микроводорослей, включая продуцентов фитотоксинов: научно-методическое пособие. Владивосток: Дальнаука. 2011. 89 c.

Особые слова признательности и благодарности авторы выражают Л.А. Ланской за введение в мир культивирования и помощь в освоении методов выделения и поддержания культур морских микроводорослей. Авторы благодарят сотрудников Биологического департамента Океанографического института Вудс-Холла (США) и особенно Дейва Кулиса за неоценимую помощь в освоении методов культивирования морских динофлагеллят. Авторы глубоко признательны научному редактору к.б.н. М.А. Ващенко и рецензенту д.б.н. В.В. Михайлову за критические замечания, ценные советы и пожелания, а также сотрудникам Лаборатории экологии шельфовых сообществ ИБМ ДВО РАН за постоянную помощь и поддержку в работе.