Для приготовления питательных сред с целью культивирования микроводорослей используют природную фильтрованную морскую воду. Природная морская вода представляет комплексный раствор, содержащий более 50 химических элементов и большое разнообразие органических компонентов (Harrison, Berges, 2005). Для приготовления питательной среды необходима морская вода только высшего качества соленостью не менее 30‰. Морскую воду для сред сохраняют в условиях, описанных выше (п. 5.2). Для приготовления сред используют литровые бутыли из тефлона (NALGENE). С целью обеспечения оптимального роста микроводорослей природную морскую воду обогащают основными минеральными солями, микроэлементами и витаминами.

При культивировании зеленых микроводорослей, как правило, применяют среду Гольдберга (Кабанова, 1961). Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, предварительно готовят четыре концентрированных раствора (табл. 1). Растворы готовят на бидистиллированной воде, для приготовления которой нельзя пользоваться аппаратами с ионообменными смолами. Концентрированные растворы солей (кроме солей железа) стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают, после чего их можно использовать для приготовления культуральной среды в течение месяца при условии хранения в темном месте при температуре 4–8°С. Каждый сосуд с питательным раствором должен быть плотно закрыт крышкой и снабжен этикеткой с указанием состава, концентрации и времени приготовления

Таблица 1

Состав исходных растворов для приготовления питательной среды Гольдберга

Компоненты среды

Концентрация, г/100 мл бидистиллированной воды

Раствор № 1

 

KNO3

10.1

Раствор № 2

 

Na2HPO4

1.421

Раствор № 3

 

MnCl2×4H2O

0.02

CoCl2×6H2O

0.024

Раствор № 4

 

FeCl3×6H2O

0.027

Для приготовления питательной среды Гольдберга в 1 л стерилизованной морской воды добавляют: раствор № 1 – 2 мл, раствор № 2 – 0.5 мл, растворы № 3 и 4 – по 1 мл последовательно, перемешивая после внесения каждого раствора.

Для культивирования микроводорослей также широко используют питательную среду f/2, которую готовят на основе фильтрованной и стерилизованной морской воды с добавлением растворов основных минеральных солей, микроэлементов и витаминов (Guillard, 1975). Для приготовления питательной среды f/2 (табл. 2) используют исходные растворы основных минеральных солей (растворы № 1–3), микроэлементов (раствор № 4) и витаминов (раствор № 5) Все указанные растворы готовят на бидистиллированной воде. Каждый сосуд с питательным раствором должен быть плотно закрыт крышкой и снабжен этикеткой с указанием состава, концентрации и времени приготовления.

Таблица 2

Состав питательной среды f/2

Компонент

Концентрация в исходном растворе, г/л бидистиллированной воды

Количество исходного раствора (мл) на 1 л среды

Концентрация в среде f/2, М

Раствор № 1

 

1

 

NaNO3

75

 

8.82×10-4

Раствор № 2

 

1

 

NaH2PO4×H2O

5

 

3.62×10-5

Раствор № 3

 

1

 

Na2SiO3×9H2O

30

 

1.06×10-4

Раствор № 4 (раствор микроэлементов)

См. табл. 3

1

 

Раствор № 5 (раствор витаминов)

См. табл. 4

0.5

 

 

 

Таблица 3

Состав исходного раствора микроэлементов для приготовления питательной среды f/2

 

Компонент

Концентрация в исходном растворе I*, г/л

Количество (г или мл) в 1 л исходного раствора II**

Концентрация в среде f/2, М

CuSO4×5H2O

9.8

1 мл

3.93×10-8

ZnSO4×7H2O

22

1 мл

7.65×10-8

CoCl2×6H2O

10

1 мл

4.2×10-8

MnCl2×4H2O

180

1 мл

9.1×10-7

Na2MoO4×2H2O

6.3

1 мл

2.6×10-8

Трилон

-

4.36 г

1.17×10-5

FeCl3×6H2O

-

3.15 г

1.17×10-5

*Первичный раствор микроэлементов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора микроэлементов.

**Раствор микроэлементов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f/2.

 

Таблица 4

Состав исходного раствора витаминов для приготовления питательной среды f/2

Компонент

Концентрация в исходном растворе I*, г/л

Количество (мг или мл) в 1 л исходного раствора II**

Концентрация в среде f/2, М

Тиамин HCl (витамин В1)

200 мг

2.96×10-7

Биотин (витамин В7)

0.1

10 мл

2.05×10-9

Цианкобаламин (витамин В12)

1.0

1 мл

3.69×10-10

*Первичный раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора витаминов.

**Раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f/2.

Чтобы получить исходный раствор микроэлементов для приготовления среды f/2, растворяют 3.15 г FeCl3×6H2O и 4.36 г трилона в 950 мл бидистиллированной воды. Затем к полученному раствору добавляют по 1 мл первичных исходных растворов остальных микроэлементов (табл. 3) и доводят объем исходного раствора микроэлементов до 1 л, добавляя бидистиллированную воду.

Чтобы получить исходный раствор витаминов для приготовления среды f/2, предварительно готовят два раствора – биотина и витамина B12 (табл. 4). Затем в 950 мл бидистиллированной воды растворяют тиамин, добавляют 10 мл исходного раствора биотина и 1 мл исходного раствора витамина B12 и доводят объем раствора витаминов до 1 л, добавляя бидистиллированную воду. Исходный раствор витаминов стерилизуют и хранят в пластиковых емкостях объемом 15 мл в замороженном виде при температуре -20ºС. Для приготовления среды f/2 емкость с витаминами предварительно размораживают. Свежеприготовленный раствор витаминов можно хранить в темном месте при температуре 4ºС не более 60 сут.

Для приготовления питательной среды f/2 в 950 мл стерилизованной морской воды добавляют по 1 мл каждого из исходных растворов основных минеральных солей (растворы № 1-3), 1 мл исходного раствора микроэлементов (раствор № 4) и 0.5 мл исходного раствора витаминов (раствор № 5) последовательно (табл. 2), перемешивая после внесения каждого раствора. Раствор натрия кремнекислого водного (раствор № 3) не используется в среде f/2, предназначенной для культивирования динофитовых водорослей.

Для культивирования диатомовых, зеленых, криптофитовых и некоторых других групп водорослей используют питательную среду f (Guillard, Ryther, 1962), в состав которой входят минеральные соли и микроэлементы (табл. 5), а также витамины (табл. 6).

Таблица 5

Состав питательной среды f

Компонент

Концентрация в исходном растворе, г/л бидистиллированной воды

Количество (мл) в 1 л среды f

Концентрация в среде f, М

Раствор № 1

 

1

 

NaNO3

150

 

17.6×10-4

NaH2PO4×H2O

10

 

7.24×10-5

Раствор № 2

 

1

 

Na2SiO3×9H2O

60

 

2.12×10-4

Раствор № 3

 

1

 

CuSO4×5H2O

0.0196

 

7.86×10-8

ZnSO4×7H2O

0.044

 

15.3×10-8

CoCl2×6H2O

0.02

 

8.4×10-8

MnCl2×4H2O

0.36

 

18.2×10-7

Na2MoO4×2H2O

0.0126

 

5.2×10-8

Раствор № 4

 

1

 

Трилон

8.7

 

2.34×10-5

Раствор № 5

 

1

 

FeCl3×6H2O

6.3

 

2.34×10-5

Раствор № 6

 

1

 

Раствор витаминов

См. табл. 6

   

Таблица 6

Состав исходного раствора витаминов для приготовления питательной среды f

 

Компонент

Концентрация в исходном растворе I*, г/л

Количество (мг или мл) в 1 л исходного раствора II**

Концентрация в среде f, М

Тиамин HCl (витамин В1)

400 мг

2.96×10-7

Биотин (витамин В7)

0.1

20 мл

2.05×10-9

Витамин В12

1.0

2 мл

3.69×10-10

*Первичный раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора витаминов.

**Раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f.

Растворы № 1−3 стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин, охлаждают и хранят в холодильнике в течение 30 сут. Для приготовления среды f в 1 л стерилизованной морской воды добавляют по 1 мл каждого из исходных растворов № 1−6 (табл. 5) последовательно, перемешивая после внесения каждого раствора. Исходный раствор витаминов для приготовления среды f готовят как описано выше для среды f/2, учитывая, что концентрация компонентов в среде f в два раза выше, чем в среде f/2 (табл. 6).

На протяжении пяти лет в Центре культивирования морских микроводорослей ИБМ ДВО РАН используют наборы для приготовления питательной среды f/2 (рис. 7), которые производит Национальный центр культивирования морского фитопланктона (CCMP), расположенный в штате Мэн, CША (https://ncma.bigelow.org/). Эти наборы содержат готовые стерильные исходные растворы основных минеральных солей, микроэлементов и витаминов (табл. 2, растворы № 1-5). Один набор рассчитан для приготовления 50 л питательной среды f/2.

Для приготовления питательных сред для культивирования необходимое количество исходного питательного раствора отбирают стерильной пипеткой и вносят в бутыли из тефлона, содержащие стерилизованную и фильтрованную морскую воду (рисунок).

Fig. 8a

Рисунок. Приготовление питательной среды на основе готовых растворов , предлагаемых CCMP.

 

Готовую среду разливают в стерильные емкости, подготовленные для инокуляции, и закрывают стерильными колпачками или крышками, которые предварительно обжигают над пламенем спиртовки. Весь процесс приготовления питательных сред, дозирования, розлива и инокуляции проводится в стерильных условиях (в ламинарном боксе, рабочие поверхности которого предварительно обрабатывают 75% раствором этилового спирта).

 

Наверх