Для приготовления питательных сред с целью культивирования микроводорослей используют природную фильтрованную морскую воду. Природная морская вода представляет комплексный раствор, содержащий более 50 химических элементов и большое разнообразие органических компонентов (Harrison, Berges, 2005). Для приготовления питательной среды необходима морская вода только высшего качества соленостью не менее 30‰. Морскую воду для сред сохраняют в условиях, описанных выше (п. 5.2). Для приготовления сред используют литровые бутыли из тефлона (NALGENE). С целью обеспечения оптимального роста микроводорослей природную морскую воду обогащают основными минеральными солями, микроэлементами и витаминами.
При культивировании зеленых микроводорослей, как правило, применяют среду Гольдберга (Кабанова, 1961). Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, предварительно готовят четыре концентрированных раствора (табл. 1). Растворы готовят на бидистиллированной воде, для приготовления которой нельзя пользоваться аппаратами с ионообменными смолами. Концентрированные растворы солей (кроме солей железа) стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают, после чего их можно использовать для приготовления культуральной среды в течение месяца при условии хранения в темном месте при температуре 4–8°С. Каждый сосуд с питательным раствором должен быть плотно закрыт крышкой и снабжен этикеткой с указанием состава, концентрации и времени приготовления
Таблица 1
Состав исходных растворов для приготовления питательной среды Гольдберга
|
Компоненты среды |
Концентрация, г/100 мл бидистиллированной воды |
|
Раствор № 1 |
|
|
KNO3 |
10.1 |
|
Раствор № 2 |
|
|
Na2HPO4 |
1.421 |
|
Раствор № 3 |
|
|
MnCl2×4H2O |
0.02 |
|
CoCl2×6H2O |
0.024 |
|
Раствор № 4 |
|
|
FeCl3×6H2O |
0.027 |
Для приготовления питательной среды Гольдберга в 1 л стерилизованной морской воды добавляют: раствор № 1 – 2 мл, раствор № 2 – 0.5 мл, растворы № 3 и 4 – по 1 мл последовательно, перемешивая после внесения каждого раствора.
Для культивирования микроводорослей также широко используют питательную среду f/2, которую готовят на основе фильтрованной и стерилизованной морской воды с добавлением растворов основных минеральных солей, микроэлементов и витаминов (Guillard, 1975). Для приготовления питательной среды f/2 (табл. 2) используют исходные растворы основных минеральных солей (растворы № 1–3), микроэлементов (раствор № 4) и витаминов (раствор № 5) Все указанные растворы готовят на бидистиллированной воде. Каждый сосуд с питательным раствором должен быть плотно закрыт крышкой и снабжен этикеткой с указанием состава, концентрации и времени приготовления.
Таблица 2
Состав питательной среды f/2
|
Компонент |
Концентрация в исходном растворе, г/л бидистиллированной воды |
Количество исходного раствора (мл) на 1 л среды |
Концентрация в среде f/2, М |
|
Раствор № 1 |
1 |
||
|
NaNO3 |
75 |
8.82×10-4 |
|
|
Раствор № 2 |
1 |
||
|
NaH2PO4×H2O |
5 |
3.62×10-5 |
|
|
Раствор № 3 |
1 |
||
|
Na2SiO3×9H2O |
30 |
1.06×10-4 |
|
|
Раствор № 4 (раствор микроэлементов) |
См. табл. 3 |
1 |
|
|
Раствор № 5 (раствор витаминов) |
См. табл. 4 |
0.5 |
Таблица 3
Состав исходного раствора микроэлементов для приготовления питательной среды f/2
|
Компонент |
Концентрация в исходном растворе I*, г/л |
Количество (г или мл) в 1 л исходного раствора II** |
Концентрация в среде f/2, М |
|
CuSO4×5H2O |
9.8 |
1 мл |
3.93×10-8 |
|
ZnSO4×7H2O |
22 |
1 мл |
7.65×10-8 |
|
CoCl2×6H2O |
10 |
1 мл |
4.2×10-8 |
|
MnCl2×4H2O |
180 |
1 мл |
9.1×10-7 |
|
Na2MoO4×2H2O |
6.3 |
1 мл |
2.6×10-8 |
|
Трилон |
- |
4.36 г |
1.17×10-5 |
|
FeCl3×6H2O |
- |
3.15 г |
1.17×10-5 |
*Первичный раствор микроэлементов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора микроэлементов.
**Раствор микроэлементов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f/2.
Таблица 4
Состав исходного раствора витаминов для приготовления питательной среды f/2
|
Компонент |
Концентрация в исходном растворе I*, г/л |
Количество (мг или мл) в 1 л исходного раствора II** |
Концентрация в среде f/2, М |
|
Тиамин HCl (витамин В1) |
− |
200 мг |
2.96×10-7 |
|
Биотин (витамин В7) |
0.1 |
10 мл |
2.05×10-9 |
|
Цианкобаламин (витамин В12) |
1.0 |
1 мл |
3.69×10-10 |
*Первичный раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора витаминов.
**Раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f/2.
Чтобы получить исходный раствор микроэлементов для приготовления среды f/2, растворяют 3.15 г FeCl3×6H2O и 4.36 г трилона в 950 мл бидистиллированной воды. Затем к полученному раствору добавляют по 1 мл первичных исходных растворов остальных микроэлементов (табл. 3) и доводят объем исходного раствора микроэлементов до 1 л, добавляя бидистиллированную воду.
Чтобы получить исходный раствор витаминов для приготовления среды f/2, предварительно готовят два раствора – биотина и витамина B12 (табл. 4). Затем в 950 мл бидистиллированной воды растворяют тиамин, добавляют 10 мл исходного раствора биотина и 1 мл исходного раствора витамина B12 и доводят объем раствора витаминов до 1 л, добавляя бидистиллированную воду. Исходный раствор витаминов стерилизуют и хранят в пластиковых емкостях объемом 15 мл в замороженном виде при температуре -20ºС. Для приготовления среды f/2 емкость с витаминами предварительно размораживают. Свежеприготовленный раствор витаминов можно хранить в темном месте при температуре 4ºС не более 60 сут.
Для приготовления питательной среды f/2 в 950 мл стерилизованной морской воды добавляют по 1 мл каждого из исходных растворов основных минеральных солей (растворы № 1-3), 1 мл исходного раствора микроэлементов (раствор № 4) и 0.5 мл исходного раствора витаминов (раствор № 5) последовательно (табл. 2), перемешивая после внесения каждого раствора. Раствор натрия кремнекислого водного (раствор № 3) не используется в среде f/2, предназначенной для культивирования динофитовых водорослей.
Для культивирования диатомовых, зеленых, криптофитовых и некоторых других групп водорослей используют питательную среду f (Guillard, Ryther, 1962), в состав которой входят минеральные соли и микроэлементы (табл. 5), а также витамины (табл. 6).
Таблица 5
Состав питательной среды f
|
Компонент |
Концентрация в исходном растворе, г/л бидистиллированной воды |
Количество (мл) в 1 л среды f |
Концентрация в среде f, М |
|
Раствор № 1 |
1 |
||
|
NaNO3 |
150 |
17.6×10-4 |
|
|
NaH2PO4×H2O |
10 |
7.24×10-5 |
|
|
Раствор № 2 |
1 |
||
|
Na2SiO3×9H2O |
60 |
2.12×10-4 |
|
|
Раствор № 3 |
1 |
||
|
CuSO4×5H2O |
0.0196 |
7.86×10-8 |
|
|
ZnSO4×7H2O |
0.044 |
15.3×10-8 |
|
|
CoCl2×6H2O |
0.02 |
8.4×10-8 |
|
|
MnCl2×4H2O |
0.36 |
18.2×10-7 |
|
|
Na2MoO4×2H2O |
0.0126 |
5.2×10-8 |
|
|
Раствор № 4 |
1 |
||
|
Трилон |
8.7 |
2.34×10-5 |
|
|
Раствор № 5 |
1 |
||
|
FeCl3×6H2O |
6.3 |
2.34×10-5 |
|
|
Раствор № 6 |
1 |
||
|
Раствор витаминов |
См. табл. 6 |
Таблица 6
Состав исходного раствора витаминов для приготовления питательной среды f
|
Компонент |
Концентрация в исходном растворе I*, г/л |
Количество (мг или мл) в 1 л исходного раствора II** |
Концентрация в среде f, М |
|
Тиамин HCl (витамин В1) |
− |
400 мг |
2.96×10-7 |
|
Биотин (витамин В7) |
0.1 |
20 мл |
2.05×10-9 |
|
Витамин В12 |
1.0 |
2 мл |
3.69×10-10 |
*Первичный раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления исходного раствора витаминов.
**Раствор витаминов, который готовят на бидистиллированной воде и используют для приготовления среды f.
Растворы № 1−3 стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин, охлаждают и хранят в холодильнике в течение 30 сут. Для приготовления среды f в 1 л стерилизованной морской воды добавляют по 1 мл каждого из исходных растворов № 1−6 (табл. 5) последовательно, перемешивая после внесения каждого раствора. Исходный раствор витаминов для приготовления среды f готовят как описано выше для среды f/2, учитывая, что концентрация компонентов в среде f в два раза выше, чем в среде f/2 (табл. 6).
На протяжении пяти лет в Центре культивирования морских микроводорослей ИБМ ДВО РАН используют наборы для приготовления питательной среды f/2 (рис. 7), которые производит Национальный центр культивирования морского фитопланктона (CCMP), расположенный в штате Мэн, CША (https://ncma.bigelow.org/). Эти наборы содержат готовые стерильные исходные растворы основных минеральных солей, микроэлементов и витаминов (табл. 2, растворы № 1-5). Один набор рассчитан для приготовления 50 л питательной среды f/2.
Для приготовления питательных сред для культивирования необходимое количество исходного питательного раствора отбирают стерильной пипеткой и вносят в бутыли из тефлона, содержащие стерилизованную и фильтрованную морскую воду (рис.8).
Рисунок 8. Приготовление питательной среды на основе готовых растворов , предлагаемых CCMP.
Готовую среду разливают в стерильные емкости, подготовленные для инокуляции, и закрывают стерильными колпачками или крышками, которые предварительно обжигают над пламенем спиртовки. Весь процесс приготовления питательных сред, дозирования, розлива и инокуляции проводится в стерильных условиях (в ламинарном боксе, рабочие поверхности которого предварительно обрабатывают 75% раствором этилового спирта).